生物學(xué)領(lǐng)域一直都是科學(xué)家們研究的重點(diǎn)，要想發(fā)展生物學(xué)領(lǐng)域，檢測(cè)儀器儀表的革新十分的重要，未來(lái)冷凍電鏡也許并不會(huì)成為科研人員的第一選擇。

在英國(guó)劍橋市一座鋼結(jié)構(gòu)建筑深處的地下室里，一場(chǎng)大規(guī)模的“叛亂”正在上演。

一個(gè)約3米高的龐大金屬箱正通過消失在屋頂上的橙色粗電纜，靜悄悄地發(fā)射兆兆字節(jié)的數(shù)據(jù)。這是全球最先進(jìn)的冷凍電子顯微鏡之一：一臺(tái)利用電子束為冷凍的生物分子成像并揭秘其分子形狀的設(shè)備。英國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（LMB）結(jié)構(gòu)生物學(xué)家SjorsScheres像個(gè)矮子一樣站在這臺(tái)價(jià)值500萬(wàn)英鎊（合770萬(wàn)美元）的設(shè)備旁邊介紹說，這臺(tái)顯微鏡非常敏感，以至于一個(gè)叫喊聲就能毀掉試驗(yàn)。

在全球?qū)嶒?yàn)室中，類似這樣的冷凍電鏡正影響著結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域。過去3年里，它們揭示了制造蛋白的核糖體細(xì)節(jié)，而這些發(fā)現(xiàn)正在以飛快的速度發(fā)表于頂級(jí)期刊。結(jié)構(gòu)生物學(xué)家們毫不夸張地認(rèn)為，他們的領(lǐng)域正處于一場(chǎng)革命當(dāng)中：冷凍電鏡能快速創(chuàng)建那些抗拒X射線結(jié)晶學(xué)和其他方法的分子的高分辨率模型。與此同時(shí)，利用此前技術(shù)獲得諾貝爾獎(jiǎng)的實(shí)驗(yàn)室正爭(zhēng)先恐后地學(xué)習(xí)這種“新貴”方法。

挑戰(zhàn)“王者”

當(dāng)1973年生物學(xué)家RichardHenderson到LMB研究一種被稱為菌視紫紅質(zhì)的蛋白時(shí)，利用光能量推動(dòng)質(zhì)子穿過細(xì)胞膜的X射線結(jié)晶學(xué)是毫無(wú)疑問的“王者”。Henderson和他的同事NigelUnwin利用這種蛋白制成二維晶體，但它們并不適合X射線衍射。因此，兩人決定嘗試電子顯微鏡。

當(dāng)時(shí)，電子顯微鏡用于研究被重金屬染色劑處理過的病毒或組織切片。一束電子被射向樣品，其中掙脫開來(lái)的電子被探測(cè)到并用于描繪它們所撞入的材料結(jié)構(gòu)。這種方法產(chǎn)生了煙草病菌的首幅清晰圖像，但染色劑使觀察單個(gè)蛋白變得困難，更不用說X射線所能揭示的原子水平上的細(xì)節(jié)。

在一個(gè)關(guān)鍵步驟中，當(dāng)Henderson和Unwin利用電子顯微鏡對(duì)菌視紫紅質(zhì)的晶片進(jìn)行成像時(shí)，他們省略了染色劑，相反把晶體放在金屬網(wǎng)格上，以便使蛋白凸顯出來(lái)。“你能看到蛋白中的原子。”和Unwin在1975年發(fā)表了菌視紫紅質(zhì)結(jié)構(gòu)的Henderson介紹說。“這是一個(gè)巨大的進(jìn)步。”美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校細(xì)胞生物學(xué)家DavidAgard表示，“這就是說，利用電子顯微鏡研究蛋白結(jié)構(gòu)將成為可能。”

冷凍電鏡領(lǐng)域在上世紀(jì)八九十年代得到發(fā)展。一個(gè)關(guān)鍵進(jìn)步是將液態(tài)乙烷用于瞬間凍結(jié)溶液中的蛋白并使其保持靜止。不過，通常情況下，這種技術(shù)仍然只能將蛋白結(jié)構(gòu)解析到10埃（1埃相當(dāng)于1納米的十分之一）的分辨率——與X射線晶體學(xué)超過4埃的模型相比并沒有競(jìng)爭(zhēng)力，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足將這些結(jié)構(gòu)用于藥物設(shè)計(jì)的要求。當(dāng)諸如美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院等資助者把上億美元投資到野心勃勃的晶體學(xué)項(xiàng)目時(shí)，對(duì)冷凍電鏡的資助遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于此。1997年，當(dāng)Henderson參加關(guān)于3D電子顯微鏡的年度高登研究會(huì)議時(shí)，一位同事在開幕式上發(fā)表了頗有挑釁意味的聲明：冷凍電鏡是一種“小生境”方法，不可能取代X射線晶體學(xué)。不過，Henderson能看到一個(gè)不同的未來(lái)，并且在隨后的演講中進(jìn)行了反駁。“當(dāng)時(shí)我說，我們應(yīng)當(dāng)讓冷凍電鏡在全球統(tǒng)治所有結(jié)構(gòu)學(xué)方法。”他回憶道。

革命從此開始

此后第二年，Henderson、Agard和其他冷凍電鏡的狂熱支持者有條不紊地實(shí)現(xiàn)了各種技術(shù)改善，尤其是找到了感知電子的更好方法。在數(shù)碼相機(jī)風(fēng)靡世界很久之后，很多電子顯微鏡專家仍然偏好過時(shí)的膠片，因?yàn)樗鼙葦?shù)字傳感器更高效地記錄電子。不過，和顯微鏡生產(chǎn)廠商一道，研究人員開發(fā)出遠(yuǎn)超膠片和數(shù)碼相機(jī)探測(cè)器的新一代直接電子探測(cè)器。

這些從2012年左右獲得應(yīng)用的探測(cè)器，能以每秒幾十幀的速率捕捉單一分子的速射圖像。與此同時(shí)，諸如Scheres等研究人員編寫了復(fù)雜的軟件程序，將上千幅2D圖像轉(zhuǎn)變成在很多情況下可與晶體學(xué)解析的分子圖像質(zhì)量相媲美的3D模型。

冷凍電鏡適合能忍受電子轟擊而不會(huì)四處晃動(dòng)的穩(wěn)定、大型分子，因此通常由幾十個(gè)蛋白制成的分子機(jī)器是很好的目標(biāo)。而研究證明，沒有什么比由RNA相互纏繞支撐的核糖體更加合適了。通過X射線晶體學(xué)解析核糖體結(jié)構(gòu)的方法，讓3位化學(xué)家獲得了2009年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。過去幾年里，不同的研究團(tuán)隊(duì)迅速發(fā)表了來(lái)自眾多生物體的核糖體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，包括首個(gè)人類核糖體高分辨率模型。在由分享了2009年諾貝爾獎(jiǎng)的VenkiRamakrishnan領(lǐng)導(dǎo)的LMB實(shí)驗(yàn)室，X射線晶體學(xué)在很大程度上變得無(wú)人問津。他認(rèn)為，對(duì)于大型分子來(lái)說，“冷凍電鏡將大幅取代晶體學(xué)技術(shù)的預(yù)測(cè)是可靠的”。

今年5月，加拿大多倫多大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家JohnRubinstein和他的同事利用約10萬(wàn)幅冷凍電鏡圖像，創(chuàng)建了一種名為V-ATPase、形狀類似轉(zhuǎn)子的酶的“分子影片”。V-ATPase通過燃燒三磷酸腺苷（ATP）推動(dòng)質(zhì)子進(jìn)出細(xì)胞液泡。“我們看到的是一切事情都在靈活進(jìn)行。”Rubinstein說，“它在彎曲、扭動(dòng)和變形。”在他看來(lái)，這種酶的靈活性能幫助其高效傳遞ATP釋放的能量。

統(tǒng)治結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域

像任何新興領(lǐng)域一樣，冷凍電鏡領(lǐng)域也有著成長(zhǎng)的煩惱。一些專家擔(dān)心，競(jìng)相利用此項(xiàng)技術(shù)的研究人員會(huì)產(chǎn)生有問題的結(jié)果。2013年發(fā)表的一種艾滋病病毒表面蛋白的結(jié)構(gòu)，便受到科學(xué)家的質(zhì)疑。他們認(rèn)為，用于構(gòu)建模型的圖像是白噪聲。從那以后，雖然其他團(tuán)隊(duì)產(chǎn)生的X射線和冷凍電鏡模型對(duì)原始模型提出了挑戰(zhàn)，但這些研究人員一直堅(jiān)守他們的成果。

今年6月，在高登會(huì)議上，想要更多質(zhì)量控制的研究人員通過一項(xiàng)決議，督促各期刊為審稿人提供關(guān)于冷凍電鏡結(jié)構(gòu)如何被創(chuàng)建的細(xì)節(jié)資料。

成本也會(huì)減緩此項(xiàng)技術(shù)的擴(kuò)散。據(jù)Scheres估算，LMB每天花費(fèi)約3000英鎊運(yùn)行其冷凍電鏡設(shè)備，還要加上1000英鎊的電費(fèi)。大部分電費(fèi)是由儲(chǔ)存和處理圖像所需的計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的。“對(duì)于很多實(shí)驗(yàn)室來(lái)說，這是一項(xiàng)很高的開支。”

為了讓冷凍電鏡的使用更加便利，一些資助者建立了研究人員能預(yù)定時(shí)間的共享設(shè)備?；羧A德·休斯醫(yī)學(xué)研究所（HHMI）在其弗吉尼亞州珍利亞農(nóng)場(chǎng)校區(qū)運(yùn)營(yíng)著一個(gè)對(duì)HHMI資助的研究人員開放的冷凍電鏡實(shí)驗(yàn)室。在英國(guó)，由政府和惠康基金會(huì)資助的一臺(tái)全國(guó)性冷凍電鏡設(shè)備，今年在牛津附近的迪德科特開始運(yùn)行。“人們想要了解冷凍電鏡，已成為當(dāng)下的一股浪潮。”幫助建立上述設(shè)備的倫敦大學(xué)伯克貝克學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)家HelenSaibil表示。

追趕這一浪潮的還有紐約洛克菲勒大學(xué)生物物理學(xué)家RodMacKinnon。他因確定了特定離子通道的晶體結(jié)構(gòu)而共同分享了2003年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，但如今卻在深入研究冷凍電鏡。“我正處在學(xué)習(xí)曲線的陡坡上，而這總是令我興奮不已。”MacKinnon希望利用冷凍電鏡研究離子通道是如何打開和關(guān)閉的。

當(dāng)Henderson在1997年反駁說冷凍電鏡將統(tǒng)治結(jié)構(gòu)生物學(xué)世界時(shí)，他或許是在口是心非。但將近20年以后，他的預(yù)言已不像當(dāng)時(shí)看上去的那么夸張。“如果繼續(xù)發(fā)展下去，并且所有技術(shù)問題都得到解決，冷凍電鏡確實(shí)會(huì)成為一種占據(jù)統(tǒng)治地位的技術(shù)，而不僅僅是第一選擇。”Henderson說，“我們或許已經(jīng)成功了一半。”

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